ЦPLOS Published: April 30, 2013 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781
Mediterranean Diet, Telomere Maintenance and Health Status among Elderly
Средиземноморская диета, поддержание теломер и состояние здоровья у пожилых людей
Virginia Boccardi, Antonietta Esposito, Maria Rosaria Rizzo, Raffaele Marfella, Michelangela Barbieri, Giuseppe Paolisso
Перевод Г.Е. Заика (26.10.2024)
Аббревиатуры:
BMI – Body Mass Index – индекс массы тела
COPD – chronic obstructive pulmonary disease – хроническая обструктивная болезнь легких
ADL – Barthel Activities of Daily Living – ежедневная деятельность Бартеля
LTL – leukocyte telomere length – Длина теломер лейкоцитов
MD – Mediterranean diet – средиземноморская диета
МDS – Mediterranean diet score – шкала средиземноморской диеты
NO – nitric oxide – оксид азота
Qfish – quantitative fluorescence in situ hybridisation – количественная флуоресцентная гибридизация in situ
Q-PCR – quantitative polymerase chain reaction – количественная полимеразная цепная реакция
TRF – terminal restriction fragment – терминальный рестрикционного фрагмента
Абстракт
Длина теломер лейкоцитов (LTL – leukocyte telomere length) и скорость укорочения теломер являются известными биомаркерами старения, в то время как многочисленные исследования показали, что средиземноморская диета (MD – Mediterranean diet) может увеличить продолжительность жизни. Мы изучали связь между длиной теломер, активностью теломеразы и различной приверженностью к МD и ее влиянием на здоровый статус. Исследование проводилось с участием 217 пожилых людей, стратифицированных по шкале средиземноморской диеты (МDS – Mediterranean diet score) в группах с низкой приверженностью (МDS≤3), средней приверженностью (МDS 4–5) и высокой приверженностью (МDS≥6). LTL измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции и активности теломеразы по протоколу PCR-ELISA. В группе с высокой приверженностью наблюдалась более длительная LTL (p = 0,003) и более высокая активность теломеразы (p = 0,013) по сравнению с другими. Линейный регрессионный анализ, включающий возраст, пол, привычку курить и МDS, показал, что МDSнезависимо связан с LTL (p = 0,024) и уровнями активности теломеразы (p = 0,006). Активность теломеразы была независимо связана с LTL (p = 0,007) и отрицательно модулировалась воспалением и окислительным стрессом. Действительно, уровни теломеразы были связаны со здоровым состоянием независимо от множественных ковариат (p = 0,048). Эти результаты подтверждают новую роль МD в укреплении здоровья, предполагая, что поддержание теломер, а не вариабельность LTL, является основным фактором, определяющим здоровый статус среди пожилых людей.
Цитирование: Boccardi V, Esposito A, Rizzo MR, Marfella R, Barbieri M, Paolisso G (2013) Средиземноморская диета, поддержание теломер и состояние здоровья среди пожилых людей. PLoSONE 8(4): e62781. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781
Редактор: Manlio Vinciguerra, University College London, United Kingdom
Получено: January 29, 2013; Принято: March 24, 2013; Опубликовано: April 30, 2013
Copyright: © 2013 Boccardi et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.
Финансирование: Эти авторы не имеют поддержки или финансирования для отчетности.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Вступление
Длина теломер, а точнее, скорость укорочения теломер, является биомаркером биологического старения [1], а употребление в пищу продуктов, богатых питательными веществами, может замедлить процесс старения и снизить риск многих хронических заболеваний [2]. Роль длины теломер в клеточном старении и развитии хронических заболеваний, связанных с физиологическим старением, рассматривалась в нескольких исследованиях [3, 4]. Несмотря на то, что длина теломер может предсказывать клинические исходы и смертность среди людей, клетки с укороченными теломерами остаются генетически стабильными, если система поддержания теломер, которая включает в себя в основном теломеразу, полностью функционирует [5]. Метаболические факторы, такие как абдоминальный жир и повышенный уровень циркулирующей глюкозы, связаны с более короткими теломерами и более низкой активностью теломеразы [6–8], что подтверждает роль образа жизни и факторов окружающей среды в поддержании теломер. Влияние диет на здоровье человека уже оценивалось во многих исследованиях, в то время как доказательства относительной важности потребления пищи для поддержания и стабильности теломер ограничены. В течение последних лет популяционные исследования и широкомасштабные клинические испытания предоставили научные доказательства того, что диета, особенно богатая фруктами, овощами, рыбой и нежирными молочными продуктами, связана с более низкой частотой различных хронических заболеваний и более высокой выживаемостью [9, 10]. Соответственно, более длительный LTL связан с более здоровым питанием, включая большее потребление антиоксидантов [11, 12], меньшее потребление обработанного мяса [12], потребление фруктов и овощей и меньшее количество пищевых жиров [13, 14]. Уже было показано, что различные питательные вещества, а также изменения в питании и образе жизни влияют на длину теломер через механизмы, отражающие их роль в клеточных функциях, включая воспаление, окислительный стресс, целостность DNA и метилирование DNA [2].
Средиземноморская диета (МD) является одной из самых здоровых диетических моделей в мире из-за ее связи с низкой заболеваемостью и смертностью при некоторых хронических заболеваниях [15, 16]. Эта диета оказывает положительное влияние на факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, такие как уровень липопротеинов, вазодилатация эндотелия, резистентность к инсулину, антиоксидантная способность, частота острого инфаркта миокарда и глобальная смертность от сердечно-сосудистых заболеваний [15]. Все больше данных свидетельствуют о том, что приверженность средиземноморскому стилю питания коррелирует с более высокой продолжительностью жизни и здоровым старением не только в странах Средиземноморского бассейна, но и в других странах за его пределами [17, 18]. Также недавно была высказана мысль о возможной связи между длиной теломер или их поддержанием и МD. Более позднее исследование in vitroпоказало, что средиземноморская диета защищает клетки от окислительного стресса, предотвращая клеточное старение, клеточный апоптоз и уменьшая истощение теломер [19]. Может ли иная адгезия к МD влиять на длину теломер и/или активность теломеразы PBMC, до сих пор неизвестно и плохо изучено. Таким образом, мы стремимся исследовать гипотезу о том, что более низкая приверженность паттерну МD может быть связана с маркерами ускоренного клеточного старения, включая снижение активности теломеразы и сокращение длины теломер у когорты пожилых людей из Южной Италии. Учитывая, что активность теломеразы PBMC связана с более низкой частотой возрастных заболеваний [20], мы также стремимся изучить потенциальную связь между длиной теломер, активностью теломеразы и соблюдением средиземноморской диеты, а также их влиянием на здоровое состояние среди пожилых людей.
Материалы и методы
Заявление об этике
Расследование было проведено в соответствии с этическими нормами. После четкого объяснения потенциального риска исследования все испытуемые предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Этическим комитетом Второго университета Неаполя.
Исследуемая популяция
Обследовано 385 европеоидов, проживающих в Кампании (Южная Италия) и направленных в наш отдел. Чтобы избежать систематической ошибки, из исследования были исключены лица с признаками острых воспалительных или инфекционных заболеваний, диабета, злокачественных новообразований, иммунологических или гематологических расстройств или лечения противовоспалительными препаратами. Всего было отобрано 217 предметов. При включении в исследование участникам были разосланы диетические анкеты и собран полный анамнез. Клиническая информация была получена путем рутинных лабораторных анализов, анамнеза и физикального осмотра. Сбор данных включал в себя интервью о демографии, поведении, связанном со здоровьем, функциональном статусе и когнитивных функциях. Валидированный опросник здоровья [21] был использован для определения наличия, анамнеза или отсутствия следующих заболеваний: гипертензия, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, деменция, рак, инсульт, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD – chronic obstructive pulmonary disease – ХОБЛ) и диабет. Для оценки физической функции мы использовали индекс ежедневной деятельности Бартеля (ADL – Barthel Activities of Daily Living), валидированный инструмент (баллы варьируют от 0 до 100) [22]. «Здоровые» пожилые люди определялись как лица с оценкой по Barthel score (шкале Бартеля) >90 (независимый диапазон) и отсутствием всех следующих заболеваний: гипертония, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, деменция, инсульт и COPD. «Нездоровый» старик имел балл по Barthel score <80 (требующий хотя бы некоторой помощи) и два или более из вышеперечисленных заболеваний [23].
Оценка средиземноморской диеты
Степень приверженности к традиционной МD оценивали с помощью шкалы средиземноморской диеты (MDS) по методике, разработанной Trichopoulou et al [24]. Потребление каждой из 9 групп продуктов питания было дихотомировано с использованием медианных значений, специфичных для пола, в качестве пороговых значений. Оценка 1 была присвоена за превышение медианного уровня предполагаемых полезных продуктов питания (овощи, бобовые, фрукты, злаки, рыба и соотношение мононенасыщенных жиров к насыщенным жирам) и потребление ниже медианного уровня предполагаемых вредных продуктов (мясо и молочные продукты). Для этанола 1 балл был присвоен мужчинам, которые потребляли от 10 до 50 г в день, и женщинам, которые потребляли от 5 до 25 г в день. Таким образом, общий МДС варьировал от 0 (минимальная приверженность традиционной средиземноморской диете) до 9 (максимальная приверженность). Для аналитических целей мы разделили МDS на три группы следующим образом: низкая приверженность (МDS≤3), средняя приверженность (МDS 4–5) и высокая приверженность (МDS≥6) к диете [24]. Пациенты, демонстрирующие непостоянное соблюдение диеты в течение последних трех месяцев, были исключены.
Аналитические методы
Антропометрические определения (вес, индекс роста и массы тела, BMI) измеряли стандартными методиками. Образцы крови были собраны утром после того, как участники голодали не менее 8 часов. Глюкозу в плазме крови определяли сразу методом глюкозооксидазы (Glucose Autoanalyzer, BeckmanCoulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Уровень холестерина и триглицеридов в плазме натощак определяли рутинными лабораторными методами (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany). Сывороточные концентрации IL-6 определяли в двух экземплярах с помощью высокочувствительного количественного анализа сэндвич-ферментов (Quantikine HS PharmPak, R&D Systems). Высокочувствительный TNF-а определяли методом иммунонефелометрии на Behring Nephelometer 2 (Dade Behring, Marburg, Germany). С-реактивный белок плазмы крови определяли с помощью автоматизированной турбидиметрии. Концентрацию нитротирозина в плазме крови, маркера окислительного стресса, определяли с помощью иммуноферментного анализа. Нитротирозин был определен, потому что эта модифицированная аминокислота является продуктом свободного радикала (O2–) взаимодействия с оксидом азота (NO). Взаимодействие O2– с NO очень быстро и приводит к инактивации NO и выработке мощного окислителя пероксинитрита. Обнаружение нитротирозина дает веские основания полагать повышенную выработку пероксинитрита [25].
Измерение активности теломеразы в PBMC
PBMC были выделены центрифугированием в градиенте Lympho-Ficoll и сохранены при температуре −80°C до анализа. Активность теломеразы в PBMC измеряли с помощью коммерческой теломеразы PCR-ELISA (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA), на основе протокола амплификации теломерных повторов. Процедуры анализа проводились в соответствии с рекомендациями производителя, при этом каждый образец анализировался в трех экземплярах.
LTL Измерение
Средняя длина теломер была количественно измерена в геномной DNA из белых кровяных телец. Геномную DNA готовили с использованием коммерческого набора для экстракции DNA в соответствии с инструкциями производителя (Nucleic Acid and Protein Purification-Macherey-Nagel). Среднее значение LTL в периферических лейкоцитах измеряли с помощью валидированного метода среднюю TL в геномной DNA путем определения отношения числа копий теломерных повторов к числу копий гена одной копии (отношение T/S) в экспериментальных образцах относительно эталонного образца. Праймеры теломер: tel1b, 5'-cggtttttttggttggttggttggttggttggttggttggtt-3', конечная концентрация 100 nМ; и tel2b, 5'-ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct-3', конечная концентрация 900 nМ. Праймерами гена с одной копией (β-глобином) являлись hbg1, 5'-gcttctg acacaactgttcactagc-3, конечная концентрация 300 nМ; и hbg2, 5'-caccaacttcatccacgtcacc-3', конечная концентрация 700 nМ. Т-сигнал для экспериментального образца ДНК — это количество нанограммов референсной ДНК, которое соответствует экспериментальному образцу по числу копий теломерных повторов. Все образцы измерялись в трех экземплярах, а для анализов использовалось среднее значение. Коэффициент вариации составил 1,98%. Результаты, полученные с помощью этого метода, очень хорошо коррелируют с результатами, полученными при традиционной длине терминального рестрикционного фрагмента (TRF – terminal restriction fragment) по методу Southern blot (Саузерн-блоттинга) [26]. Для получения TL для референсной DNA мы использовали отношения T/S 30 образцов DNA с известными средними длинами TRF, полученными по методике. Относительные отношения T/S и средняя длина теломер по методу Southern blot (Саузерн-блоттинга) достоверно коррелировали (r = 0,667; p = 0,001). Наклон линии линейной регрессии через график отношения T/S (ось x) от средней длины TRF (ось y) — это количество пар оснований теломерной DNA, соответствующих одной единице T/S. ТЛ была успешно измерена у всех 217 человек.
Расчеты и статистический анализ
Наблюдаемые данные имеют нормальное распределение (Shapiro-Wilk W-Test) и представлены в виде средних значений ± стандартного отклонения (SD – Standard Deviation). Для оценки различий в клинических и биохимических данных между представленными группами использовали однофакторный ANOVA с последующей коррекцией множественного тестирования Bonferroni (Бонферрони). Коэффициенты корреляции Pearson были рассчитаны для оценки взаимосвязи между возрастом испытуемых и LTL, как указано.
Кластерный анализ позволил нам оценить, связана ли кластеризация переменных воспаления с вариабельностью LTL. Для этой цели мы создали составную оценку, называемую кластерной оценкой. Z-оценка количественно определяет исходную оценку в терминах количества SD, которое является оценкой из среднего значения распределения. Он рассчитывался как сумма z-баллов основной переменной воспаления (IL-6, TNF-α и CRP). Z-оценка указывает на положение отдельного значения переменной в общем распределении переменной в генеральной совокупности и рассчитывается следующим образом: (индивидуальное значение - среднее значение)/SD.
Линейный регрессионный анализ был использован для проверки связи различной приверженности средиземноморской диете с уровнями активности LTL и теломеразы независимо от множественных искажающих факторов. Бинарный логистический регрессионный анализ был использован для проверки связи между уровнями активности теломеразы и здоровым состоянием независимо от множественных ковариат. Поскольку некоторые из предикторных переменных, использованных в регрессионном анализе, были коррелированы, мы провели анализ коллинеарности. Используя терминального рестрикционного фрагмента (TRF – terminal restriction fragment)), в наших данных не было обнаружено проблем с коллинеарностью. Расчет размера выборки проводился на компьютере IBM PC с помощью программного обеспечения GPOWER. Полученный общий размер выборки, оцененный в соответствии с размером глобального эффекта 25% с погрешностью I типа 0,05 и мощностью 90%, составил 207 пациентов. Все представленные значения p являются двуххвостыми, и для уровней значимости было выбрано p≤0.05. Статистический анализ проводился с помощью программного комплекса SPSS 17 (SPSS, Inc., Chicago, IL) or GraphPad Prism software version 5.0 (SanDiego, CA,USA).
Результаты
Характеристики всей исследуемой популяции
В исследование включено 217 неродственных европеоидов (115 (53%) мужчин и 102 (47%) женщины). Участники были пожилыми (средний возраст = 77,9±2,7 года) и с небольшим избыточным весом (индекс массы тела (BMI – Body Mass Index – ИМТ) = 25,8±1,4 кг/м2) с одинаковой пропорцией между мужчинами и женщинами. Средний возраст участников составил 78,0±2,9 лет для мужчин (диапазон 71–86) и 77,7±2,5 года для женщин (диапазон 71–87). По гендерному соотношению у женщин было значительно меньше BMI (25,3±1,3 kg/m2 vs 26,2±1,4 kg/m2, p = 0,001) сравнивали мужчин, при этом не было обнаружено различий между другими клиническими и биохимическими характеристиками, а также биомаркерами воспаления и окислительного стресса (данные не показаны).
Как и ожидалось, во всей исследуемой популяции была обнаружена статистически значимая обратная корреляция между LTL и возрастом (r = −0,258, p<0,001). В частности, с каждым 1-летним увеличением возраста LTL уменьшается на 0,058 Кб. Независимо от возраста, у женщин LTL был значительно длиннее, чем у мужчин (5,06 Кb±0,56 Кb и 4,73 Кб±0,60 Кб соответственно, p<0,001), при этом не было обнаружено различий в уровнях активности теломеразы PBMC (0,88±0,20 OD против 0,88±0,19 OD) между полами.
При стратификации у некурящих, бывших курильщиков и ныне курильщиков выявлена статистически значимая разница в вариабельности LTL между группами (4,98 Кb±0,61 Кb, 4,92 Кb±0,54 Кb и 4,49 Кb±0,53 Кb соответственно, p<0,001), при этом различий в активности базальной теломеразы между группами не обнаружено (0,89±0,20 OD, 0,85±0,21 OD и 0,91±0,17 соответственно, p = 0,375 ).
Значимая положительная корреляция (r = 0,151; p = 0,028) между длиной теломер и уровнями активности теломеразы PBMC была обнаружена даже после поправки на возраст, пол и привычку курить (рис. 1).
BMI – Body Mass Index – индекс массы тела
COPD – chronic obstructive pulmonary disease – хроническая обструктивная болезнь легких
ADL – Barthel Activities of Daily Living – ежедневная деятельность Бартеля
LTL – leukocyte telomere length – Длина теломер лейкоцитов
MD – Mediterranean diet – средиземноморская диета
МDS – Mediterranean diet score – шкала средиземноморской диеты
NO – nitric oxide – оксид азота
Qfish – quantitative fluorescence in situ hybridisation – количественная флуоресцентная гибридизация in situ
Q-PCR – quantitative polymerase chain reaction – количественная полимеразная цепная реакция
TRF – terminal restriction fragment – терминальный рестрикционного фрагмента
Абстракт
Длина теломер лейкоцитов (LTL – leukocyte telomere length) и скорость укорочения теломер являются известными биомаркерами старения, в то время как многочисленные исследования показали, что средиземноморская диета (MD – Mediterranean diet) может увеличить продолжительность жизни. Мы изучали связь между длиной теломер, активностью теломеразы и различной приверженностью к МD и ее влиянием на здоровый статус. Исследование проводилось с участием 217 пожилых людей, стратифицированных по шкале средиземноморской диеты (МDS – Mediterranean diet score) в группах с низкой приверженностью (МDS≤3), средней приверженностью (МDS 4–5) и высокой приверженностью (МDS≥6). LTL измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции и активности теломеразы по протоколу PCR-ELISA. В группе с высокой приверженностью наблюдалась более длительная LTL (p = 0,003) и более высокая активность теломеразы (p = 0,013) по сравнению с другими. Линейный регрессионный анализ, включающий возраст, пол, привычку курить и МDS, показал, что МDSнезависимо связан с LTL (p = 0,024) и уровнями активности теломеразы (p = 0,006). Активность теломеразы была независимо связана с LTL (p = 0,007) и отрицательно модулировалась воспалением и окислительным стрессом. Действительно, уровни теломеразы были связаны со здоровым состоянием независимо от множественных ковариат (p = 0,048). Эти результаты подтверждают новую роль МD в укреплении здоровья, предполагая, что поддержание теломер, а не вариабельность LTL, является основным фактором, определяющим здоровый статус среди пожилых людей.
Цитирование: Boccardi V, Esposito A, Rizzo MR, Marfella R, Barbieri M, Paolisso G (2013) Средиземноморская диета, поддержание теломер и состояние здоровья среди пожилых людей. PLoSONE 8(4): e62781. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781
Редактор: Manlio Vinciguerra, University College London, United Kingdom
Получено: January 29, 2013; Принято: March 24, 2013; Опубликовано: April 30, 2013
Copyright: © 2013 Boccardi et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.
Финансирование: Эти авторы не имеют поддержки или финансирования для отчетности.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Вступление
Длина теломер, а точнее, скорость укорочения теломер, является биомаркером биологического старения [1], а употребление в пищу продуктов, богатых питательными веществами, может замедлить процесс старения и снизить риск многих хронических заболеваний [2]. Роль длины теломер в клеточном старении и развитии хронических заболеваний, связанных с физиологическим старением, рассматривалась в нескольких исследованиях [3, 4]. Несмотря на то, что длина теломер может предсказывать клинические исходы и смертность среди людей, клетки с укороченными теломерами остаются генетически стабильными, если система поддержания теломер, которая включает в себя в основном теломеразу, полностью функционирует [5]. Метаболические факторы, такие как абдоминальный жир и повышенный уровень циркулирующей глюкозы, связаны с более короткими теломерами и более низкой активностью теломеразы [6–8], что подтверждает роль образа жизни и факторов окружающей среды в поддержании теломер. Влияние диет на здоровье человека уже оценивалось во многих исследованиях, в то время как доказательства относительной важности потребления пищи для поддержания и стабильности теломер ограничены. В течение последних лет популяционные исследования и широкомасштабные клинические испытания предоставили научные доказательства того, что диета, особенно богатая фруктами, овощами, рыбой и нежирными молочными продуктами, связана с более низкой частотой различных хронических заболеваний и более высокой выживаемостью [9, 10]. Соответственно, более длительный LTL связан с более здоровым питанием, включая большее потребление антиоксидантов [11, 12], меньшее потребление обработанного мяса [12], потребление фруктов и овощей и меньшее количество пищевых жиров [13, 14]. Уже было показано, что различные питательные вещества, а также изменения в питании и образе жизни влияют на длину теломер через механизмы, отражающие их роль в клеточных функциях, включая воспаление, окислительный стресс, целостность DNA и метилирование DNA [2].
Средиземноморская диета (МD) является одной из самых здоровых диетических моделей в мире из-за ее связи с низкой заболеваемостью и смертностью при некоторых хронических заболеваниях [15, 16]. Эта диета оказывает положительное влияние на факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, такие как уровень липопротеинов, вазодилатация эндотелия, резистентность к инсулину, антиоксидантная способность, частота острого инфаркта миокарда и глобальная смертность от сердечно-сосудистых заболеваний [15]. Все больше данных свидетельствуют о том, что приверженность средиземноморскому стилю питания коррелирует с более высокой продолжительностью жизни и здоровым старением не только в странах Средиземноморского бассейна, но и в других странах за его пределами [17, 18]. Также недавно была высказана мысль о возможной связи между длиной теломер или их поддержанием и МD. Более позднее исследование in vitroпоказало, что средиземноморская диета защищает клетки от окислительного стресса, предотвращая клеточное старение, клеточный апоптоз и уменьшая истощение теломер [19]. Может ли иная адгезия к МD влиять на длину теломер и/или активность теломеразы PBMC, до сих пор неизвестно и плохо изучено. Таким образом, мы стремимся исследовать гипотезу о том, что более низкая приверженность паттерну МD может быть связана с маркерами ускоренного клеточного старения, включая снижение активности теломеразы и сокращение длины теломер у когорты пожилых людей из Южной Италии. Учитывая, что активность теломеразы PBMC связана с более низкой частотой возрастных заболеваний [20], мы также стремимся изучить потенциальную связь между длиной теломер, активностью теломеразы и соблюдением средиземноморской диеты, а также их влиянием на здоровое состояние среди пожилых людей.
Материалы и методы
Заявление об этике
Расследование было проведено в соответствии с этическими нормами. После четкого объяснения потенциального риска исследования все испытуемые предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Этическим комитетом Второго университета Неаполя.
Исследуемая популяция
Обследовано 385 европеоидов, проживающих в Кампании (Южная Италия) и направленных в наш отдел. Чтобы избежать систематической ошибки, из исследования были исключены лица с признаками острых воспалительных или инфекционных заболеваний, диабета, злокачественных новообразований, иммунологических или гематологических расстройств или лечения противовоспалительными препаратами. Всего было отобрано 217 предметов. При включении в исследование участникам были разосланы диетические анкеты и собран полный анамнез. Клиническая информация была получена путем рутинных лабораторных анализов, анамнеза и физикального осмотра. Сбор данных включал в себя интервью о демографии, поведении, связанном со здоровьем, функциональном статусе и когнитивных функциях. Валидированный опросник здоровья [21] был использован для определения наличия, анамнеза или отсутствия следующих заболеваний: гипертензия, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, деменция, рак, инсульт, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD – chronic obstructive pulmonary disease – ХОБЛ) и диабет. Для оценки физической функции мы использовали индекс ежедневной деятельности Бартеля (ADL – Barthel Activities of Daily Living), валидированный инструмент (баллы варьируют от 0 до 100) [22]. «Здоровые» пожилые люди определялись как лица с оценкой по Barthel score (шкале Бартеля) >90 (независимый диапазон) и отсутствием всех следующих заболеваний: гипертония, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, деменция, инсульт и COPD. «Нездоровый» старик имел балл по Barthel score <80 (требующий хотя бы некоторой помощи) и два или более из вышеперечисленных заболеваний [23].
Оценка средиземноморской диеты
Степень приверженности к традиционной МD оценивали с помощью шкалы средиземноморской диеты (MDS) по методике, разработанной Trichopoulou et al [24]. Потребление каждой из 9 групп продуктов питания было дихотомировано с использованием медианных значений, специфичных для пола, в качестве пороговых значений. Оценка 1 была присвоена за превышение медианного уровня предполагаемых полезных продуктов питания (овощи, бобовые, фрукты, злаки, рыба и соотношение мононенасыщенных жиров к насыщенным жирам) и потребление ниже медианного уровня предполагаемых вредных продуктов (мясо и молочные продукты). Для этанола 1 балл был присвоен мужчинам, которые потребляли от 10 до 50 г в день, и женщинам, которые потребляли от 5 до 25 г в день. Таким образом, общий МДС варьировал от 0 (минимальная приверженность традиционной средиземноморской диете) до 9 (максимальная приверженность). Для аналитических целей мы разделили МDS на три группы следующим образом: низкая приверженность (МDS≤3), средняя приверженность (МDS 4–5) и высокая приверженность (МDS≥6) к диете [24]. Пациенты, демонстрирующие непостоянное соблюдение диеты в течение последних трех месяцев, были исключены.
Аналитические методы
Антропометрические определения (вес, индекс роста и массы тела, BMI) измеряли стандартными методиками. Образцы крови были собраны утром после того, как участники голодали не менее 8 часов. Глюкозу в плазме крови определяли сразу методом глюкозооксидазы (Glucose Autoanalyzer, BeckmanCoulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Уровень холестерина и триглицеридов в плазме натощак определяли рутинными лабораторными методами (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany). Сывороточные концентрации IL-6 определяли в двух экземплярах с помощью высокочувствительного количественного анализа сэндвич-ферментов (Quantikine HS PharmPak, R&D Systems). Высокочувствительный TNF-а определяли методом иммунонефелометрии на Behring Nephelometer 2 (Dade Behring, Marburg, Germany). С-реактивный белок плазмы крови определяли с помощью автоматизированной турбидиметрии. Концентрацию нитротирозина в плазме крови, маркера окислительного стресса, определяли с помощью иммуноферментного анализа. Нитротирозин был определен, потому что эта модифицированная аминокислота является продуктом свободного радикала (O2–) взаимодействия с оксидом азота (NO). Взаимодействие O2– с NO очень быстро и приводит к инактивации NO и выработке мощного окислителя пероксинитрита. Обнаружение нитротирозина дает веские основания полагать повышенную выработку пероксинитрита [25].
Измерение активности теломеразы в PBMC
PBMC были выделены центрифугированием в градиенте Lympho-Ficoll и сохранены при температуре −80°C до анализа. Активность теломеразы в PBMC измеряли с помощью коммерческой теломеразы PCR-ELISA (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA), на основе протокола амплификации теломерных повторов. Процедуры анализа проводились в соответствии с рекомендациями производителя, при этом каждый образец анализировался в трех экземплярах.
LTL Измерение
Средняя длина теломер была количественно измерена в геномной DNA из белых кровяных телец. Геномную DNA готовили с использованием коммерческого набора для экстракции DNA в соответствии с инструкциями производителя (Nucleic Acid and Protein Purification-Macherey-Nagel). Среднее значение LTL в периферических лейкоцитах измеряли с помощью валидированного метода среднюю TL в геномной DNA путем определения отношения числа копий теломерных повторов к числу копий гена одной копии (отношение T/S) в экспериментальных образцах относительно эталонного образца. Праймеры теломер: tel1b, 5'-cggtttttttggttggttggttggttggttggttggttggtt-3', конечная концентрация 100 nМ; и tel2b, 5'-ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct-3', конечная концентрация 900 nМ. Праймерами гена с одной копией (β-глобином) являлись hbg1, 5'-gcttctg acacaactgttcactagc-3, конечная концентрация 300 nМ; и hbg2, 5'-caccaacttcatccacgtcacc-3', конечная концентрация 700 nМ. Т-сигнал для экспериментального образца ДНК — это количество нанограммов референсной ДНК, которое соответствует экспериментальному образцу по числу копий теломерных повторов. Все образцы измерялись в трех экземплярах, а для анализов использовалось среднее значение. Коэффициент вариации составил 1,98%. Результаты, полученные с помощью этого метода, очень хорошо коррелируют с результатами, полученными при традиционной длине терминального рестрикционного фрагмента (TRF – terminal restriction fragment) по методу Southern blot (Саузерн-блоттинга) [26]. Для получения TL для референсной DNA мы использовали отношения T/S 30 образцов DNA с известными средними длинами TRF, полученными по методике. Относительные отношения T/S и средняя длина теломер по методу Southern blot (Саузерн-блоттинга) достоверно коррелировали (r = 0,667; p = 0,001). Наклон линии линейной регрессии через график отношения T/S (ось x) от средней длины TRF (ось y) — это количество пар оснований теломерной DNA, соответствующих одной единице T/S. ТЛ была успешно измерена у всех 217 человек.
Расчеты и статистический анализ
Наблюдаемые данные имеют нормальное распределение (Shapiro-Wilk W-Test) и представлены в виде средних значений ± стандартного отклонения (SD – Standard Deviation). Для оценки различий в клинических и биохимических данных между представленными группами использовали однофакторный ANOVA с последующей коррекцией множественного тестирования Bonferroni (Бонферрони). Коэффициенты корреляции Pearson были рассчитаны для оценки взаимосвязи между возрастом испытуемых и LTL, как указано.
Кластерный анализ позволил нам оценить, связана ли кластеризация переменных воспаления с вариабельностью LTL. Для этой цели мы создали составную оценку, называемую кластерной оценкой. Z-оценка количественно определяет исходную оценку в терминах количества SD, которое является оценкой из среднего значения распределения. Он рассчитывался как сумма z-баллов основной переменной воспаления (IL-6, TNF-α и CRP). Z-оценка указывает на положение отдельного значения переменной в общем распределении переменной в генеральной совокупности и рассчитывается следующим образом: (индивидуальное значение - среднее значение)/SD.
Линейный регрессионный анализ был использован для проверки связи различной приверженности средиземноморской диете с уровнями активности LTL и теломеразы независимо от множественных искажающих факторов. Бинарный логистический регрессионный анализ был использован для проверки связи между уровнями активности теломеразы и здоровым состоянием независимо от множественных ковариат. Поскольку некоторые из предикторных переменных, использованных в регрессионном анализе, были коррелированы, мы провели анализ коллинеарности. Используя терминального рестрикционного фрагмента (TRF – terminal restriction fragment)), в наших данных не было обнаружено проблем с коллинеарностью. Расчет размера выборки проводился на компьютере IBM PC с помощью программного обеспечения GPOWER. Полученный общий размер выборки, оцененный в соответствии с размером глобального эффекта 25% с погрешностью I типа 0,05 и мощностью 90%, составил 207 пациентов. Все представленные значения p являются двуххвостыми, и для уровней значимости было выбрано p≤0.05. Статистический анализ проводился с помощью программного комплекса SPSS 17 (SPSS, Inc., Chicago, IL) or GraphPad Prism software version 5.0 (SanDiego, CA,USA).
Результаты
Характеристики всей исследуемой популяции
В исследование включено 217 неродственных европеоидов (115 (53%) мужчин и 102 (47%) женщины). Участники были пожилыми (средний возраст = 77,9±2,7 года) и с небольшим избыточным весом (индекс массы тела (BMI – Body Mass Index – ИМТ) = 25,8±1,4 кг/м2) с одинаковой пропорцией между мужчинами и женщинами. Средний возраст участников составил 78,0±2,9 лет для мужчин (диапазон 71–86) и 77,7±2,5 года для женщин (диапазон 71–87). По гендерному соотношению у женщин было значительно меньше BMI (25,3±1,3 kg/m2 vs 26,2±1,4 kg/m2, p = 0,001) сравнивали мужчин, при этом не было обнаружено различий между другими клиническими и биохимическими характеристиками, а также биомаркерами воспаления и окислительного стресса (данные не показаны).
Как и ожидалось, во всей исследуемой популяции была обнаружена статистически значимая обратная корреляция между LTL и возрастом (r = −0,258, p<0,001). В частности, с каждым 1-летним увеличением возраста LTL уменьшается на 0,058 Кб. Независимо от возраста, у женщин LTL был значительно длиннее, чем у мужчин (5,06 Кb±0,56 Кb и 4,73 Кб±0,60 Кб соответственно, p<0,001), при этом не было обнаружено различий в уровнях активности теломеразы PBMC (0,88±0,20 OD против 0,88±0,19 OD) между полами.
При стратификации у некурящих, бывших курильщиков и ныне курильщиков выявлена статистически значимая разница в вариабельности LTL между группами (4,98 Кb±0,61 Кb, 4,92 Кb±0,54 Кb и 4,49 Кb±0,53 Кb соответственно, p<0,001), при этом различий в активности базальной теломеразы между группами не обнаружено (0,89±0,20 OD, 0,85±0,21 OD и 0,91±0,17 соответственно, p = 0,375 ).
Значимая положительная корреляция (r = 0,151; p = 0,028) между длиной теломер и уровнями активности теломеразы PBMC была обнаружена даже после поправки на возраст, пол и привычку курить (рис. 1).
Рисунок 1. Корреляция между LTL и активностью теломеразы во всех популяционных исследованиях.
Частичные корреляции (r = 0,208; p = 0,002) между длиной теломер лейкоцитов (LTL) и активностью теломеразы PBMC во всей исследуемой популяции (n = 217), скорректированные по полу, возрасту и привычке курения. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0062781.g001
Характеристики исследуемой популяции в соответствии с оценкой средиземноморской диеты
В таблице 1 описаны общие клинические и биохимические характеристики участников в соответствии с подгруппами MDS (Mediterranean Diet Score): низкая приверженность (MDS≤3), средняя приверженность (MDS 4–5) и высокая приверженность (MDS≥6). 32,3% показали низкую приверженность (MDS≤3) средиземноморской диете, 31,3% − среднюю приверженность (MDS 4–5) и 36,4% − высокую приверженность (MDS≥6). Ни один из участников не набрал 9 баллов, что является показателем максимальной приверженности средиземноморской диете. Была обнаружена более высокая частота женщин, некурящих и «здоровых» субъектов в группе с высокой приверженностью.
Частичные корреляции (r = 0,208; p = 0,002) между длиной теломер лейкоцитов (LTL) и активностью теломеразы PBMC во всей исследуемой популяции (n = 217), скорректированные по полу, возрасту и привычке курения. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0062781.g001
Характеристики исследуемой популяции в соответствии с оценкой средиземноморской диеты
В таблице 1 описаны общие клинические и биохимические характеристики участников в соответствии с подгруппами MDS (Mediterranean Diet Score): низкая приверженность (MDS≤3), средняя приверженность (MDS 4–5) и высокая приверженность (MDS≥6). 32,3% показали низкую приверженность (MDS≤3) средиземноморской диете, 31,3% − среднюю приверженность (MDS 4–5) и 36,4% − высокую приверженность (MDS≥6). Ни один из участников не набрал 9 баллов, что является показателем максимальной приверженности средиземноморской диете. Была обнаружена более высокая частота женщин, некурящих и «здоровых» субъектов в группе с высокой приверженностью.
Таблица 1. Характеристики исследуемой популяции (n = 217) в соответствии с оценкой средиземноморской диеты.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.t001
Участники с самой высокой приверженностью к МD (МDS≥6) показали большую длину теломер (p = 0,003), а также более высокую активность теломеразы (p = 0,013) по сравнению с другими группами (рис. 2). Такая разница оказалась значимой даже после поправки на возраст, пол и привычки курения (p = 0,043 и p = 0,048 соответственно). Каждые 1 год приращения LTL уменьшается на 0,072 Кб (β = −0,456, p = 0,001), 0,057 (β = −0,284, p = 0,043) и 0,051 (β = −0,293, p = 0,015) в группах с низкой приверженностью, средней и высокой приверженностью соответственно, демонстрируя статистически различную убыль теломер между группами МДС (p = 0,001) вместе со старением.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.t001
Участники с самой высокой приверженностью к МD (МDS≥6) показали большую длину теломер (p = 0,003), а также более высокую активность теломеразы (p = 0,013) по сравнению с другими группами (рис. 2). Такая разница оказалась значимой даже после поправки на возраст, пол и привычки курения (p = 0,043 и p = 0,048 соответственно). Каждые 1 год приращения LTL уменьшается на 0,072 Кб (β = −0,456, p = 0,001), 0,057 (β = −0,284, p = 0,043) и 0,051 (β = −0,293, p = 0,015) в группах с низкой приверженностью, средней и высокой приверженностью соответственно, демонстрируя статистически различную убыль теломер между группами МДС (p = 0,001) вместе со старением.
Рисунок 2. LTL и активность теломеразы в соответствии с подгруппами средиземноморской диеты.
Данные являются средними ± стандартным отклонением. MDS≤3: n = 70; МДС 4–5: n = 68; MDS≥6: n = 79. Значения p были получены с помощью ANOVA с последующей коррекцией множественного тестирования Бонферрони. А) *p = 0,003; MDS≥6 против MDS≤3 p = 0,009 и MDS≥6 против MDS 4–5 p = 0,011 B) *p = 0,013; МDS≥6 против МDS≤3 р = 0,028 и МDS≥6 против МDS 4–5 р = 0,033. LTL, длина теломер лейкоцитов; MDS, оценка средиземноморской диеты.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.g002
Независимое влияние диеты на длину теломер и вариабельность активности теломеразы PBMC проверяли с помощью линейного регрессионного анализа, контролирующего множественные ковариаты. Модели, включающие возраст, пол, привычку курить и МDS, показали, что МDS независимо связаны с вариабельностью LTL (β = 0,141, p = 0,024; R2 = 0,209) и уровни активности теломеразы (табл. 2, модель 1). Модель, в которой LTL была зависимой переменной и возраст, пол, привычка курить, MDS и активность теломеразы как независимые переменные, показала, что активность теломеразы (β = 0,167 p = 0,007; R2 = 0,226), но не MDS (β = 0,110, p = 0,181) был независимо связан с вариабельностью LTL. В этой последней модели возраст, пол и привычка курить были независимо связаны с вариабельностью LTL.
Данные являются средними ± стандартным отклонением. MDS≤3: n = 70; МДС 4–5: n = 68; MDS≥6: n = 79. Значения p были получены с помощью ANOVA с последующей коррекцией множественного тестирования Бонферрони. А) *p = 0,003; MDS≥6 против MDS≤3 p = 0,009 и MDS≥6 против MDS 4–5 p = 0,011 B) *p = 0,013; МDS≥6 против МDS≤3 р = 0,028 и МDS≥6 против МDS 4–5 р = 0,033. LTL, длина теломер лейкоцитов; MDS, оценка средиземноморской диеты.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.g002
Независимое влияние диеты на длину теломер и вариабельность активности теломеразы PBMC проверяли с помощью линейного регрессионного анализа, контролирующего множественные ковариаты. Модели, включающие возраст, пол, привычку курить и МDS, показали, что МDS независимо связаны с вариабельностью LTL (β = 0,141, p = 0,024; R2 = 0,209) и уровни активности теломеразы (табл. 2, модель 1). Модель, в которой LTL была зависимой переменной и возраст, пол, привычка курить, MDS и активность теломеразы как независимые переменные, показала, что активность теломеразы (β = 0,167 p = 0,007; R2 = 0,226), но не MDS (β = 0,110, p = 0,181) был независимо связан с вариабельностью LTL. В этой последней модели возраст, пол и привычка курить были независимо связаны с вариабельностью LTL.
Таблица 2. Линейный регрессионный анализ с активностью теломеразы в качестве зависимой переменной (n = 217).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.t002
Средиземноморская диета, воспалительные процессы и система поддержания теломер
У пациентов с самым высоким показателем приверженности (МDS ≥6) наблюдались более низкие плазматические уровни CRP (0,41±0,31 mg/dl против 0,56±0,46 mg/dl, p = 0,018), IL-6 (2,27±0,76 pg/mlпротив 2,55±0,65 pg/ml, p = 0,010), TNF-α (2,33±0,71 pg/ml против 2,62±0,62 pg/ml, p = 0,021) и нитротирозина (0,23±0,07 µmol/L против 0,26±0,07 µmol/L, p = 0,009) по сравнению с группой с низкой приверженностью соответственно.
Анализ частичной корреляции, контролируемый по возрасту, полу и привычке курить, показал, что LTL отрицательно коррелирует с оценкой воспаления (r = −0,244; p<0,001), а также с нитротирозином (r = −0,174; p = 0,011). Уровни активности теломеразы PBMC отрицательно коррелировали как с воспалением (r = −0,138; p = 0,048), так и с уровнем нитротирозина (r = −0,157; p = 0,022). Оценка воспаления, рассчитанная как сумма z-баллов основной переменной воспаления, СRP, IL-6 и TNF-α, положительно коррелировала с уровнями нитротирозина (r = 0,556, p<0,001).
Тестирование влияния множественных ковариат на уровни активности теломеразы, линейный регрессионный анализ, контролирующий возраст, пол, привычку курения, МDS и оценку воспаления, показало, что воспаление, но не МDS, независимо связано с вариабельностью активности теломеразы (Таблица 2, Модель 2).
Средиземноморская диета, система поддержания теломер и здоровый статус
Классификация людей как «здоровых старых» (Barthel score >90 и отсутствие всех следующих заболеваний: гипертония, инфаркт миокарда, сосудистые заболевания, деменция, инсульт, застойная сердечная недостаточность) и как «нездоровые старики» (Barthel score <80 и двух или более из вышеуказанных заболеваний), была обнаружена более высокая частота здоровых субъектов в группе МD с самой высокой приверженностью. Здоровые старики (n = 99) показали достоверно большую длину теломер (5,01 Кb±0,58 Кb против 4,79 Кb±0,61 Кb, p = 0,008) по сравнению с нездоровой группой (n = 118), а также более высокую активность теломеразы PBMC (0,92±0,19 против 0,85±0,20, p = 0,022). Бинарный логистический регрессионный анализ с состоянием здоровья в качестве зависимой переменной и возрастом, полом, привычкой курения, воспалением, уровнями активности теломеразы, LTL и MDS в качестве ковариат показал, что только активность теломеразы была независимо связана с улучшением состояния здоровья (отношение шансов = 4,257, 95% CI = 1,011–17,926, p = 0,048).
Обсуждение
Истощение теломер происходит в результате клеточной репликации и ускоряется различными факторами окружающей среды, такими как воспаление и окислительный стресс [1]. Более длительный LTL связан с более здоровым питанием [27], хотя, насколько нам известно, относительное влияние специфической диеты на активность LTL и теломеразы у человека плохо изучено [12, 14]. Средиземноморская диета является одной из самых здоровых диетических моделей в мире из-за ее связи с низкой заболеваемостью и смертностью от некоторых хронических заболеваний, потенциально влияющих на продолжительность жизни и продолжительность здоровья [15, 16]. Тем не менее, остается неизвестным, как именно традиционное MD может повлиять на продолжительность жизни, хотя данные показывают, что общая структура питания, а не какая-либо конкретная пища, может увеличить продолжительность жизни. Хорошо известно, что одним из важных эффектов средиземноморской диеты в увеличении продолжительности жизни является снижение системного окислительного стресса и воспаления [28, 29]. Таким образом, мы предположили, что средиземноморская диета будет связана со скоростью укорочения теломер и активностью теломеразы в соответствии с сообщениями о связи между такой диетой и воспалением, хроническими заболеваниями и уровнем смертности.
Используя данные популяционного исследования пожилых людей из средиземноморской области Кампании (Южная Италия), мы обнаружили доказательства ретроспективной связи между высокой приверженностью средиземноморскому стилю питания и системой поддержания теломер. Основныевыводы нашего расследования:
i) более высокая адгезия к МD в значительной степени коррелирует с длиной теломер, независимо от множества искажающих переменных, влияющих на истирание теломер
ii) PBMC Активность теломеразы в значительной степени и независимо связана с вариабельностью LTL
iii) MD независимо связан с изменчивостью LTL
iiii) Активность теломеразы связана со здоровым состоянием независимо от множества искажающих факторов, включая вариабельность LTL.
На данный момент это первое исследование, направленное на изучение взаимосвязи между длиной теломер, активностью теломеразы PBMC и приверженностью средиземноморской диете среди пожилых людей. Наше исследование показывает, что люди с самой высокой приверженностью этой диете имеют большую длину теломер и более высокий уровень активности теломеразы в периферических белых кровяных клетках, независимо от множества смешанных переменных. Мы предположили, что высокая приверженность средиземноморской диете, влияющая на уровень активности теломеразы PBMC, связана с меньшим истощением теломер вместе с возрастом. Фактически, мы обнаружили положительную связь между длиной теломер и приверженностью к МD, независимо от множества смешанных переменных, которые, как известно, влияют на истощение теломер.
Многие факторы, такие как генетические факторы и факторы окружающей среды, модулируют истощение LTL, даже если теломеры могут оставаться генетически стабильными, если система поддержания теломер, которая включает в себя в основном теломеразу, полностью функционирует. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что различные питательные вещества, а также изменения в рационе питания и образе жизни могут влиять на длину теломер [14] через механизмы, которые отражают их роль во многих клеточных функциях, включая воспаление, окислительный стресс и, возможно, активность теломеразы PBMC [30]. Важно отметить, что мы обнаружили, что более длительный LTL коррелирует с более высокой активностью теломеразы PBMC, в то время как стратификация субъектов в соответствии с MDS, участники с более высокой приверженностью к MD демонстрируют более длинные теломеры, а также более высокую активность теломеразы PBMC. МDSнезависимо связан как с длиной теломер, так и с уровнями активности теломеразы, но наиболее важным является то, что регрессионная модель показывает, что влияние МD на вариабельность LTL опосредовано уровнями активности теломеразы независимо от множественных искажающих факторов. Эти результаты являются новыми и инновационными, подтверждающими предыдущие данные, показывающие, что более высокая активность теломеразы в PBMC в ответ на изменения в диете и образе жизни [14, 30]. Недавно Ornish et al. [14] показали, что диета может модулировать активность теломеразы в PBMC, в то время как если такой эффект приводит к изменению скорости укорочения теломер, то это неясно. Интересно, что здесь мы обнаружили, что активность теломеразы PBMC в значительной степени и независимо связана с вариабельностью LTL. Возможное объяснение такого открытия заключается в том, что высокая приверженность средиземноморской диете может стимулировать активность теломеразы PBMC, либо напрямую за счет воздействия некоторых конкретных питательных веществ, включенных в рацион, либо косвенно за счет глобального влияния диеты на модуляцию воспаления и окислительный статус. Соответственно, мы обнаружили, что пациенты с более высокой приверженностью к МД имеют более низкий плазматический уровень воспалительного субстрата и окислительного стресса, о чем свидетельствуют более низкие уровни СRP, IL-6, TNF-α и нитротирозина. Влияние диеты не зависит от основных переменных, влияющих на изменчивость LTL. Интересно, что активация теломеразы in vitro способствует долголетию клеток и стабильности генома [31], и ни в одном исследовании не оценивался такой эффект in vivo. Активность теломеразы является важным фактором, определяющим длину теломер, и ее можно считать новым маркером, измеренным в очень немногих исследованиях на людях. Согласно предыдущим исследованиям [23], мы показываем, что пожилые люди с лучшим здоровым статусом имеют более длительный LTL, и сначала мы показываем, что лучшее здоровое состояние связано с более высокой активностью теломеразы PBMC. Мы проверили связь между активностью теломеразы и здоровым статусом и обнаружили значимую положительную связь независимо от множества искажающих факторов, что позволяет предположить, что стабильность теломер, а не LTL, может быть основным фактором, определяющим здоровый статус.
Таким образом, можно предположить, что более высокая активность теломеразы в PBMCs в результате качества приверженности к МD может иметь важное клиническое значение и может представлять собой новые биомаркеры здорового старения. В недавних исследованиях, проведенных на мышиной модели, было показано, что активация теломеразы, индуцированная генной терапией [32, 33] или стимулятором TA-65 [34], замедляет физиологическое старение и продлевает продолжительность жизни. Наиболее важным является то, что эти исследования показывают, что активация теломеразы связана с улучшением определенных показателей здоровья, включая толерантность к глюкозе, остеопороз и физическую форму кожи, без значительного увеличения заболеваемости раком во всем мире. Опять же, у мышей активность теломеразы связана со снижением уровня холестерина LDL [14], играя важную роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний [35]. Тем не менее, значение увеличения активности теломеразы у человека остается невыясненным. Наши результаты в пожилом пособии показывают более низкую частоту хронических заболеваний, таких как гипертония, инфаркт миокарда, сосудистые заболевания, деменция, инсульт, застойная сердечная недостаточность среди людей с более высокими уровнями активности циркулирующей теломеразы. Впервые показано влияние средиземноморской диеты на модуляцию активности теломеразы у людей. Наши результаты, показывающие более высокую частоту здоровых людей с более высокой активностью теломеразы, а также более длинными теломерами в подгруппе с высоким уровнем соблюдения, подтверждают новую роль средиземноморской диеты в укреплении здоровья. Можно предположить, что целостность поддержания теломер и связанная с ней стабильность по сравнению с индивидуальным LTL, является основным фактором, определяющим здоровое состояние пожилых людей.
Ограниченное число субъектов и отсутствие повторного исследования являются потенциальными ограничениями этого исследования. Еще одним ограничением является метод, используемый для оценки средней длины теломер, анализ количественной qPCR. Сообщалось, что анализ показал сильную корреляцию со средней длиной теломер, измеренной по Южному блоттингу [26]. В нашем исследовании корреляция немного слабее. Этот вывод может быть объяснен небольшим размером выборки, а также тем, что Южный блот измеряет переменное количество нетеломерной DNAследовательно, корреляция не ожидается идеальной. Тем не менее, в нашем популяционном исследовании мы обнаружили снижение LTL с увеличением старения, а также более короткий LTL у мужчин, что представляет собой очень хороший контроль качества. Протокол количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Qfish – quantitative fluorescence in situ hybridisation) [36] с использованием специфических кислотных зондов для гибридизации с теломерными повторами будет более точным по сравнению с используемым подходом, таким образом, потребуются дальнейшие исследования для повторения и подтверждения наших результатов.
В заключение можно сказать, что наши результаты свидетельствуют о наличии связи между высокой приверженностью к МD и более медленными темпами клеточного старения. В совокупности все эти данные подтверждают новую гипотезу о том, что более низкая скорость укорочения теломер и более высокая активность теломеразы PBMC могут влиять на продолжительность жизни и, что наиболее важно, на продолжительность здоровья среди населения, потребляющего традиционную средиземноморскую диету.
Вклад авторов
Задумали и осуществили эксперименты: VB GP MB MRR RM. Выполнили эксперименты: AE VB. Проанализировали данные: VB MB RM MRR GP AE. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: VB AE. Написали статью: VB MB GP.
References
1. Kimura M, Barbieri M, Gardner JP, Skurnick J, Cao X, et al. (2007) Leukocytes of exceptionally old persons display ultra-short telomeres. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 293(6): R2210–7. View Article Google Scholar
2. Ligi P (2011) Diet, nutrition and telomere length. Journal of Nutritional Biochemistry 22: 895–901. View Article Google Scholar
3. Donate LE, Blasco MA (2011) Telomeres in cancer and ageing. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366(1561): 76–84. View Article Google Scholar
4. Oeseburg H, de Boer RA, van Gilst WH, van der Harst P (2010) Telomere biology in healthy aging and disease. Pflugers Arch. 459(2): 259–68. View Article Google Scholar
5. Blackburn EH (2005) Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Lett 579: 859–62. View Article Google Scholar
6. Epel ES, Lin J, Wilhelm FH, Wolkowitz OM, Cawthon R, et al. (2006) Cell aging in relation to stress arousal and cardiovascular disease risk factors Psychoneuroendocrinology. 31(3): 277–287. View Article Google Scholar
7. Valdes AM, Andrew T, Gardner JP, Kimura M, Oelsner E, et al. (2005) Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet 366 (9486): 662–664. View Article Google Scholar
8. Gardner JP, Li S, Srinivasan SR, Chen W, Kimura M, et al. (2005) Rise in insulin resistance is associated with escalated telomere attrition. Circulation 111 (17): 2171–2177. View Article Google Scholar
9. Hu FB (2003) Plant-based foods and prevention of cardiovascular disease: an overview. Am J Clin Nutr 78: 544S–551S. View Article Google Scholar
10. Anderson AL, Harris TB, Tylavsky FA, Perry SE, Houston DK, et al. (2011) Health ABC Study. Dietary patterns and survival of older adults. J Am Diet Assoc 111(1): 84–91. View Article Google Scholar
11. Xu Q, Parks CG, DeRoo LA, Cawthon RM, Sandler DP, et al. (2009) Multivitamin use and telomere length in women. Am J Clin Nut 89 (6): 1857–1863. View Article Google Scholar
12. Nettleton JA, Diez-Roux A, Jenny NS, Fitzpatrick AL, Jacobs DR Jr (2008) Dietary patterns, food groups, and telomere length in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA). Am J Clin Nutr 88(5): 1405–1412. View Article Google Scholar
13. Mirabello L, Huang WY, Wong JY, Chatterjee N, Reding D, et al. (2009) The association between leukocyte telomere length and cigarette smoking, dietary and physical variables, and risk of prostate cancer. Aging Cell 8(4): 405–413. View Article Google Scholar
14. Ornish D, Lin J, Daubenmier J, Weidner G, Epel E, et al. (2008) Increased telomerase activity and comprehensive lifestyle changes: a pilot study. Lancet Oncol 9: 1048–57. View Article Google Scholar
15. Sofi F, Cesari F, Abbate R, Gensini GF, Casini A (2008) Adherence to Mediterranean diet and health status: meta-analysis. BMJ 11: 337a1344. View Article Google Scholar
16. Trichopoulou A (2004) Traditional Mediterranean diet and longevity in the elderly: a review. Public Health Nutr 7(7): 943–7. View Article Google Scholar
17. Kouris-Blazos A, Gnardellis C, Wahlqvist ML, Trichopoulos D, Lukito W, et al. (1999) Are the advantages of the Mediterranean diet transferable to other populations? A cohort study in Melbourne, Australia. Br J Nutr 82: 57–61. View Article Google Scholar
18. Haveman-Nies A, de Groot LCPGM, van Staveren WA (2003) Dietary quality, lifestyle factors and healthy ageing in Europe: the SENECA study. Age and Aging 32: 427–34. View Article Google Scholar
19. Marin C, Delgado-Lista J, Ramirez R, Carracedo J, Caballero J, et al. (2011) Mediterranean diet reduces senescence-associated stress in endothelial cells. Age (Dordr). 34(6): 1309–16. View Article Google Scholar
20. Garcia CK, Wright WE, Shay JW (2007) Human diseases of telomerase dysfunction: insights into tissue aging. Nucleic Acids Res 35(22): 7406–7416. View Article Google Scholar
21. Terry D, Sebastiani P, Andersen S, Perls T (2008) Disentangling the roles of disability and morbidity in survival to exceptional old age. Arch Intern Med 168: 277–283. View Article Google Scholar
22. Mahoney FI, Barthel DW (1965) Functional evaluation: The Barthel Index. A simple index of independence useful in scoring improvement in the rehabilitation of the chronically ill. Md State Med J 14: 61–65. View Article Google Scholar
23. Terry DF, Nolan VG, Andersen SL, Perls TT, Cawthorn R (2008) Association of Longer Telomeres With Better Health in Centenarians. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63(8): 809–812. View Article Google Scholar
24. Trichopoulou A, Costacou T, Bamia C, Trichopoulos D (2003) Adherence to a Mediterranean diet and survival in a Greek population. N Engl J Med 348(26): 2599–2608. View Article Google Scholar
25. Ischiropoulos H (1998) Biological tyrosine nitration: a pathophysiological function of nitric oxide and reactive oxygen species. Arch Biochem Biophys 356: 1–11. View Article Google Scholar
26. Cawthon RM (2002) Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res 30: e47. View Article Google Scholar
27. Cassidy A, De Vivo I, Liu Y, Han J, Prescott J, et al. (2010) Associations between diet, lifestyle factors, and telomere length in women. Am J Clin Nutr. 91(5): 1273–80. View Article Google Scholar
28. Dai J, Miller AH, Bremner JD, Goldberg J, Jones L, et al. (2008) Adherence to the Mediterranean diet is inversely associated with circulating interleukin-6 among middle aged men: a twin study. Circulation 117: 169–75. View Article Google Scholar
29. Dai J, Jones DP, Goldberg J, Dai J, Jones DP, et al. (2008) Association between adherence to the Mediterranean diet and oxidative stress. Am J Clin Nutr 88(5): 1364–70. View Article Google Scholar
30. Daubenmier J, Lin J, Blackburn E, Hecht FM, Kristeller J, et al. (2012) Changes in stress, eating, and metabolic factors are related to changes in telomerase activity in a randomized mindfulness intervention pilot study. Psychoneuroendocrinology. 37(7): 917–28. View Article Google Scholar
31. Zhu J, Wang H, Bishop JM, Blackburn EH (1999) Telomerase extends the lifespan of virus-transformed human cells without net telomere lengthening. Proc Natl Acad Sci USA 96: 3723–28. View Article Google Scholar
32. Bernardes de Jesus B, Vera E, Schneeberger K, Tejera AM, Ayuso E, et al. (2012) Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increases longevity without increasing cancer. EMBO Mol Med 4(8): 691–704. View Article Google Scholar
33. Boccardi V, Herbig U (2012) Telomerase gene therapy: a novel approach to combat aging. EMBO Mol Med 4(8): 685–7. View Article Google Scholar
34. Bernardes de Jesus B, Schneeberger K, Vera E, Tejera A, Harley CB, et al. (2011) The telomerase activator TA-65 elongates short telomeres and increases health span of adult/old mice without increasing cancer incidence. Aging Cell 10(4): 604–21. View Article Google Scholar
35. Serrano AL, Andres V (2004) Telomeres and cardiovascular disease: does size matter? Circ Res 94 (5): 575–584. View Article Google Scholar
36. Canela A, Vera E, Klatt P, Blasco MA (2007) High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proc Nat Acad Sci 104 (13): 5300–5305. View Article Google Scholar
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062781.t002
Средиземноморская диета, воспалительные процессы и система поддержания теломер
У пациентов с самым высоким показателем приверженности (МDS ≥6) наблюдались более низкие плазматические уровни CRP (0,41±0,31 mg/dl против 0,56±0,46 mg/dl, p = 0,018), IL-6 (2,27±0,76 pg/mlпротив 2,55±0,65 pg/ml, p = 0,010), TNF-α (2,33±0,71 pg/ml против 2,62±0,62 pg/ml, p = 0,021) и нитротирозина (0,23±0,07 µmol/L против 0,26±0,07 µmol/L, p = 0,009) по сравнению с группой с низкой приверженностью соответственно.
Анализ частичной корреляции, контролируемый по возрасту, полу и привычке курить, показал, что LTL отрицательно коррелирует с оценкой воспаления (r = −0,244; p<0,001), а также с нитротирозином (r = −0,174; p = 0,011). Уровни активности теломеразы PBMC отрицательно коррелировали как с воспалением (r = −0,138; p = 0,048), так и с уровнем нитротирозина (r = −0,157; p = 0,022). Оценка воспаления, рассчитанная как сумма z-баллов основной переменной воспаления, СRP, IL-6 и TNF-α, положительно коррелировала с уровнями нитротирозина (r = 0,556, p<0,001).
Тестирование влияния множественных ковариат на уровни активности теломеразы, линейный регрессионный анализ, контролирующий возраст, пол, привычку курения, МDS и оценку воспаления, показало, что воспаление, но не МDS, независимо связано с вариабельностью активности теломеразы (Таблица 2, Модель 2).
Средиземноморская диета, система поддержания теломер и здоровый статус
Классификация людей как «здоровых старых» (Barthel score >90 и отсутствие всех следующих заболеваний: гипертония, инфаркт миокарда, сосудистые заболевания, деменция, инсульт, застойная сердечная недостаточность) и как «нездоровые старики» (Barthel score <80 и двух или более из вышеуказанных заболеваний), была обнаружена более высокая частота здоровых субъектов в группе МD с самой высокой приверженностью. Здоровые старики (n = 99) показали достоверно большую длину теломер (5,01 Кb±0,58 Кb против 4,79 Кb±0,61 Кb, p = 0,008) по сравнению с нездоровой группой (n = 118), а также более высокую активность теломеразы PBMC (0,92±0,19 против 0,85±0,20, p = 0,022). Бинарный логистический регрессионный анализ с состоянием здоровья в качестве зависимой переменной и возрастом, полом, привычкой курения, воспалением, уровнями активности теломеразы, LTL и MDS в качестве ковариат показал, что только активность теломеразы была независимо связана с улучшением состояния здоровья (отношение шансов = 4,257, 95% CI = 1,011–17,926, p = 0,048).
Обсуждение
Истощение теломер происходит в результате клеточной репликации и ускоряется различными факторами окружающей среды, такими как воспаление и окислительный стресс [1]. Более длительный LTL связан с более здоровым питанием [27], хотя, насколько нам известно, относительное влияние специфической диеты на активность LTL и теломеразы у человека плохо изучено [12, 14]. Средиземноморская диета является одной из самых здоровых диетических моделей в мире из-за ее связи с низкой заболеваемостью и смертностью от некоторых хронических заболеваний, потенциально влияющих на продолжительность жизни и продолжительность здоровья [15, 16]. Тем не менее, остается неизвестным, как именно традиционное MD может повлиять на продолжительность жизни, хотя данные показывают, что общая структура питания, а не какая-либо конкретная пища, может увеличить продолжительность жизни. Хорошо известно, что одним из важных эффектов средиземноморской диеты в увеличении продолжительности жизни является снижение системного окислительного стресса и воспаления [28, 29]. Таким образом, мы предположили, что средиземноморская диета будет связана со скоростью укорочения теломер и активностью теломеразы в соответствии с сообщениями о связи между такой диетой и воспалением, хроническими заболеваниями и уровнем смертности.
Используя данные популяционного исследования пожилых людей из средиземноморской области Кампании (Южная Италия), мы обнаружили доказательства ретроспективной связи между высокой приверженностью средиземноморскому стилю питания и системой поддержания теломер. Основныевыводы нашего расследования:
i) более высокая адгезия к МD в значительной степени коррелирует с длиной теломер, независимо от множества искажающих переменных, влияющих на истирание теломер
ii) PBMC Активность теломеразы в значительной степени и независимо связана с вариабельностью LTL
iii) MD независимо связан с изменчивостью LTL
iiii) Активность теломеразы связана со здоровым состоянием независимо от множества искажающих факторов, включая вариабельность LTL.
На данный момент это первое исследование, направленное на изучение взаимосвязи между длиной теломер, активностью теломеразы PBMC и приверженностью средиземноморской диете среди пожилых людей. Наше исследование показывает, что люди с самой высокой приверженностью этой диете имеют большую длину теломер и более высокий уровень активности теломеразы в периферических белых кровяных клетках, независимо от множества смешанных переменных. Мы предположили, что высокая приверженность средиземноморской диете, влияющая на уровень активности теломеразы PBMC, связана с меньшим истощением теломер вместе с возрастом. Фактически, мы обнаружили положительную связь между длиной теломер и приверженностью к МD, независимо от множества смешанных переменных, которые, как известно, влияют на истощение теломер.
Многие факторы, такие как генетические факторы и факторы окружающей среды, модулируют истощение LTL, даже если теломеры могут оставаться генетически стабильными, если система поддержания теломер, которая включает в себя в основном теломеразу, полностью функционирует. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что различные питательные вещества, а также изменения в рационе питания и образе жизни могут влиять на длину теломер [14] через механизмы, которые отражают их роль во многих клеточных функциях, включая воспаление, окислительный стресс и, возможно, активность теломеразы PBMC [30]. Важно отметить, что мы обнаружили, что более длительный LTL коррелирует с более высокой активностью теломеразы PBMC, в то время как стратификация субъектов в соответствии с MDS, участники с более высокой приверженностью к MD демонстрируют более длинные теломеры, а также более высокую активность теломеразы PBMC. МDSнезависимо связан как с длиной теломер, так и с уровнями активности теломеразы, но наиболее важным является то, что регрессионная модель показывает, что влияние МD на вариабельность LTL опосредовано уровнями активности теломеразы независимо от множественных искажающих факторов. Эти результаты являются новыми и инновационными, подтверждающими предыдущие данные, показывающие, что более высокая активность теломеразы в PBMC в ответ на изменения в диете и образе жизни [14, 30]. Недавно Ornish et al. [14] показали, что диета может модулировать активность теломеразы в PBMC, в то время как если такой эффект приводит к изменению скорости укорочения теломер, то это неясно. Интересно, что здесь мы обнаружили, что активность теломеразы PBMC в значительной степени и независимо связана с вариабельностью LTL. Возможное объяснение такого открытия заключается в том, что высокая приверженность средиземноморской диете может стимулировать активность теломеразы PBMC, либо напрямую за счет воздействия некоторых конкретных питательных веществ, включенных в рацион, либо косвенно за счет глобального влияния диеты на модуляцию воспаления и окислительный статус. Соответственно, мы обнаружили, что пациенты с более высокой приверженностью к МД имеют более низкий плазматический уровень воспалительного субстрата и окислительного стресса, о чем свидетельствуют более низкие уровни СRP, IL-6, TNF-α и нитротирозина. Влияние диеты не зависит от основных переменных, влияющих на изменчивость LTL. Интересно, что активация теломеразы in vitro способствует долголетию клеток и стабильности генома [31], и ни в одном исследовании не оценивался такой эффект in vivo. Активность теломеразы является важным фактором, определяющим длину теломер, и ее можно считать новым маркером, измеренным в очень немногих исследованиях на людях. Согласно предыдущим исследованиям [23], мы показываем, что пожилые люди с лучшим здоровым статусом имеют более длительный LTL, и сначала мы показываем, что лучшее здоровое состояние связано с более высокой активностью теломеразы PBMC. Мы проверили связь между активностью теломеразы и здоровым статусом и обнаружили значимую положительную связь независимо от множества искажающих факторов, что позволяет предположить, что стабильность теломер, а не LTL, может быть основным фактором, определяющим здоровый статус.
Таким образом, можно предположить, что более высокая активность теломеразы в PBMCs в результате качества приверженности к МD может иметь важное клиническое значение и может представлять собой новые биомаркеры здорового старения. В недавних исследованиях, проведенных на мышиной модели, было показано, что активация теломеразы, индуцированная генной терапией [32, 33] или стимулятором TA-65 [34], замедляет физиологическое старение и продлевает продолжительность жизни. Наиболее важным является то, что эти исследования показывают, что активация теломеразы связана с улучшением определенных показателей здоровья, включая толерантность к глюкозе, остеопороз и физическую форму кожи, без значительного увеличения заболеваемости раком во всем мире. Опять же, у мышей активность теломеразы связана со снижением уровня холестерина LDL [14], играя важную роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний [35]. Тем не менее, значение увеличения активности теломеразы у человека остается невыясненным. Наши результаты в пожилом пособии показывают более низкую частоту хронических заболеваний, таких как гипертония, инфаркт миокарда, сосудистые заболевания, деменция, инсульт, застойная сердечная недостаточность среди людей с более высокими уровнями активности циркулирующей теломеразы. Впервые показано влияние средиземноморской диеты на модуляцию активности теломеразы у людей. Наши результаты, показывающие более высокую частоту здоровых людей с более высокой активностью теломеразы, а также более длинными теломерами в подгруппе с высоким уровнем соблюдения, подтверждают новую роль средиземноморской диеты в укреплении здоровья. Можно предположить, что целостность поддержания теломер и связанная с ней стабильность по сравнению с индивидуальным LTL, является основным фактором, определяющим здоровое состояние пожилых людей.
Ограниченное число субъектов и отсутствие повторного исследования являются потенциальными ограничениями этого исследования. Еще одним ограничением является метод, используемый для оценки средней длины теломер, анализ количественной qPCR. Сообщалось, что анализ показал сильную корреляцию со средней длиной теломер, измеренной по Южному блоттингу [26]. В нашем исследовании корреляция немного слабее. Этот вывод может быть объяснен небольшим размером выборки, а также тем, что Южный блот измеряет переменное количество нетеломерной DNAследовательно, корреляция не ожидается идеальной. Тем не менее, в нашем популяционном исследовании мы обнаружили снижение LTL с увеличением старения, а также более короткий LTL у мужчин, что представляет собой очень хороший контроль качества. Протокол количественной флуоресцентной гибридизации in situ (Qfish – quantitative fluorescence in situ hybridisation) [36] с использованием специфических кислотных зондов для гибридизации с теломерными повторами будет более точным по сравнению с используемым подходом, таким образом, потребуются дальнейшие исследования для повторения и подтверждения наших результатов.
В заключение можно сказать, что наши результаты свидетельствуют о наличии связи между высокой приверженностью к МD и более медленными темпами клеточного старения. В совокупности все эти данные подтверждают новую гипотезу о том, что более низкая скорость укорочения теломер и более высокая активность теломеразы PBMC могут влиять на продолжительность жизни и, что наиболее важно, на продолжительность здоровья среди населения, потребляющего традиционную средиземноморскую диету.
Вклад авторов
Задумали и осуществили эксперименты: VB GP MB MRR RM. Выполнили эксперименты: AE VB. Проанализировали данные: VB MB RM MRR GP AE. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: VB AE. Написали статью: VB MB GP.
References
1. Kimura M, Barbieri M, Gardner JP, Skurnick J, Cao X, et al. (2007) Leukocytes of exceptionally old persons display ultra-short telomeres. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 293(6): R2210–7. View Article Google Scholar
2. Ligi P (2011) Diet, nutrition and telomere length. Journal of Nutritional Biochemistry 22: 895–901. View Article Google Scholar
3. Donate LE, Blasco MA (2011) Telomeres in cancer and ageing. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366(1561): 76–84. View Article Google Scholar
4. Oeseburg H, de Boer RA, van Gilst WH, van der Harst P (2010) Telomere biology in healthy aging and disease. Pflugers Arch. 459(2): 259–68. View Article Google Scholar
5. Blackburn EH (2005) Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Lett 579: 859–62. View Article Google Scholar
6. Epel ES, Lin J, Wilhelm FH, Wolkowitz OM, Cawthon R, et al. (2006) Cell aging in relation to stress arousal and cardiovascular disease risk factors Psychoneuroendocrinology. 31(3): 277–287. View Article Google Scholar
7. Valdes AM, Andrew T, Gardner JP, Kimura M, Oelsner E, et al. (2005) Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet 366 (9486): 662–664. View Article Google Scholar
8. Gardner JP, Li S, Srinivasan SR, Chen W, Kimura M, et al. (2005) Rise in insulin resistance is associated with escalated telomere attrition. Circulation 111 (17): 2171–2177. View Article Google Scholar
9. Hu FB (2003) Plant-based foods and prevention of cardiovascular disease: an overview. Am J Clin Nutr 78: 544S–551S. View Article Google Scholar
10. Anderson AL, Harris TB, Tylavsky FA, Perry SE, Houston DK, et al. (2011) Health ABC Study. Dietary patterns and survival of older adults. J Am Diet Assoc 111(1): 84–91. View Article Google Scholar
11. Xu Q, Parks CG, DeRoo LA, Cawthon RM, Sandler DP, et al. (2009) Multivitamin use and telomere length in women. Am J Clin Nut 89 (6): 1857–1863. View Article Google Scholar
12. Nettleton JA, Diez-Roux A, Jenny NS, Fitzpatrick AL, Jacobs DR Jr (2008) Dietary patterns, food groups, and telomere length in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA). Am J Clin Nutr 88(5): 1405–1412. View Article Google Scholar
13. Mirabello L, Huang WY, Wong JY, Chatterjee N, Reding D, et al. (2009) The association between leukocyte telomere length and cigarette smoking, dietary and physical variables, and risk of prostate cancer. Aging Cell 8(4): 405–413. View Article Google Scholar
14. Ornish D, Lin J, Daubenmier J, Weidner G, Epel E, et al. (2008) Increased telomerase activity and comprehensive lifestyle changes: a pilot study. Lancet Oncol 9: 1048–57. View Article Google Scholar
15. Sofi F, Cesari F, Abbate R, Gensini GF, Casini A (2008) Adherence to Mediterranean diet and health status: meta-analysis. BMJ 11: 337a1344. View Article Google Scholar
16. Trichopoulou A (2004) Traditional Mediterranean diet and longevity in the elderly: a review. Public Health Nutr 7(7): 943–7. View Article Google Scholar
17. Kouris-Blazos A, Gnardellis C, Wahlqvist ML, Trichopoulos D, Lukito W, et al. (1999) Are the advantages of the Mediterranean diet transferable to other populations? A cohort study in Melbourne, Australia. Br J Nutr 82: 57–61. View Article Google Scholar
18. Haveman-Nies A, de Groot LCPGM, van Staveren WA (2003) Dietary quality, lifestyle factors and healthy ageing in Europe: the SENECA study. Age and Aging 32: 427–34. View Article Google Scholar
19. Marin C, Delgado-Lista J, Ramirez R, Carracedo J, Caballero J, et al. (2011) Mediterranean diet reduces senescence-associated stress in endothelial cells. Age (Dordr). 34(6): 1309–16. View Article Google Scholar
20. Garcia CK, Wright WE, Shay JW (2007) Human diseases of telomerase dysfunction: insights into tissue aging. Nucleic Acids Res 35(22): 7406–7416. View Article Google Scholar
21. Terry D, Sebastiani P, Andersen S, Perls T (2008) Disentangling the roles of disability and morbidity in survival to exceptional old age. Arch Intern Med 168: 277–283. View Article Google Scholar
22. Mahoney FI, Barthel DW (1965) Functional evaluation: The Barthel Index. A simple index of independence useful in scoring improvement in the rehabilitation of the chronically ill. Md State Med J 14: 61–65. View Article Google Scholar
23. Terry DF, Nolan VG, Andersen SL, Perls TT, Cawthorn R (2008) Association of Longer Telomeres With Better Health in Centenarians. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63(8): 809–812. View Article Google Scholar
24. Trichopoulou A, Costacou T, Bamia C, Trichopoulos D (2003) Adherence to a Mediterranean diet and survival in a Greek population. N Engl J Med 348(26): 2599–2608. View Article Google Scholar
25. Ischiropoulos H (1998) Biological tyrosine nitration: a pathophysiological function of nitric oxide and reactive oxygen species. Arch Biochem Biophys 356: 1–11. View Article Google Scholar
26. Cawthon RM (2002) Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res 30: e47. View Article Google Scholar
27. Cassidy A, De Vivo I, Liu Y, Han J, Prescott J, et al. (2010) Associations between diet, lifestyle factors, and telomere length in women. Am J Clin Nutr. 91(5): 1273–80. View Article Google Scholar
28. Dai J, Miller AH, Bremner JD, Goldberg J, Jones L, et al. (2008) Adherence to the Mediterranean diet is inversely associated with circulating interleukin-6 among middle aged men: a twin study. Circulation 117: 169–75. View Article Google Scholar
29. Dai J, Jones DP, Goldberg J, Dai J, Jones DP, et al. (2008) Association between adherence to the Mediterranean diet and oxidative stress. Am J Clin Nutr 88(5): 1364–70. View Article Google Scholar
30. Daubenmier J, Lin J, Blackburn E, Hecht FM, Kristeller J, et al. (2012) Changes in stress, eating, and metabolic factors are related to changes in telomerase activity in a randomized mindfulness intervention pilot study. Psychoneuroendocrinology. 37(7): 917–28. View Article Google Scholar
31. Zhu J, Wang H, Bishop JM, Blackburn EH (1999) Telomerase extends the lifespan of virus-transformed human cells without net telomere lengthening. Proc Natl Acad Sci USA 96: 3723–28. View Article Google Scholar
32. Bernardes de Jesus B, Vera E, Schneeberger K, Tejera AM, Ayuso E, et al. (2012) Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increases longevity without increasing cancer. EMBO Mol Med 4(8): 691–704. View Article Google Scholar
33. Boccardi V, Herbig U (2012) Telomerase gene therapy: a novel approach to combat aging. EMBO Mol Med 4(8): 685–7. View Article Google Scholar
34. Bernardes de Jesus B, Schneeberger K, Vera E, Tejera A, Harley CB, et al. (2011) The telomerase activator TA-65 elongates short telomeres and increases health span of adult/old mice without increasing cancer incidence. Aging Cell 10(4): 604–21. View Article Google Scholar
35. Serrano AL, Andres V (2004) Telomeres and cardiovascular disease: does size matter? Circ Res 94 (5): 575–584. View Article Google Scholar
36. Canela A, Vera E, Klatt P, Blasco MA (2007) High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proc Nat Acad Sci 104 (13): 5300–5305. View Article Google Scholar
