Мульти-омический анализ выявляет влияние генетических факторов риска и факторов окружающей среды на развитие микробиоты кишечника у младенцев с риском развития целиакии
Maureen M. Leonard,1,2,3,4 Hiren Karathia,#5 Meritxell Pujolassos,#6 Jacopo Troisi,#6,7,8 FrancescoValitutti,#8,9 Poorani Subramanian,#5 Stephanie Camhi,2,4 Victoria Kenyon,2,4 Angelo Colucci,6,7 GloriaSerena,1,2,3,4 Salvatore Cucchiara,10 Monica Montuori,10 Basilio Malamisura,11 Ruggiero Francavilla,12Luca Elli,13 Brian Fanelli,5 Rita Colwell,5,14 Nur Hasan,5 Ali R. Zomorrodi,
1,2,3,4 Alessio Fasano,
1,2,3,4,8and the CD-GEMM Team
Перевод Г.Е. Заика (20.11.2022)
Аббревиатуры:
CD – Celiac disease – Целиакия
CDGEMM – Celiac Disease Genomic, Environmental, Microbiome and Metabolome – генома, окружающей среды, микробиома и метаболома целиакии
HLA – Human leukocyte antigen – Человеческий лейкоцитарный антиген
IBD – Inflammatory bowel disease – воспалительное заболевание толстойкики
T1D – Type 1 diabetes – Тип 1 диабета
Абстракт
Предпосылки
Целиакия (CD – Celiac disease) – это аутоиммунное расстройство пищеварения, которое возникает у генетически восприимчивых людей в ответ на употребление глютена, белка, содержащегося в пшенице, ржи и ячмене. Исследования показывают, что генетическая предрасположенность и воздействие глютена необходимы, но не достаточны для того, чтобы спровоцировать развитие CD. Это говорит о том, что воздействие других факторов окружающей среды в раннем возрасте, например, кесарево сечение и воздействие антибиотиков или искусственных смесей, также может играть ключевую роль в патогенезе CD посредством пока неизвестных механизмов. Здесь мы используем мульти-омический анализ, чтобы исследовать, как генетические факторы риска и ранние факторы окружающей среды влияют на развитие кишечной микробиоты у младенцев с риском развития CD.
Результаты
С этой целью мы отобрали 31 младенца из крупномасштабного проспективного когортного исследования новорождённых с родственником первой степени с CD. Затем мы провели тщательный многомерный ассоциативный, поперечный и продольный анализы с использованием метагеномных и метаболомных данных, собранных при рождении, в возрасте 3 месяцев и 6 месяцев, чтобы изучить влияние генетической предрасположенности и факторов риска окружающей среды на состав, функцию и метаболом кишечной микробиоты до введения триггера (глютена).. Эти анализы выявили несколько видов микробов, функциональных путей и метаболитов, которые связаны с каждым генетическим фактором риска и фактором окружающей среды или которые по-разному распространены у младенцев, подвергшихся воздействию окружающей среды, и у детей, не подвергшихся воздействию, или между временными точками. Среди наших важных открытий мы обнаружили, что родоразрешение с помощью кесарева сечения связано с уменьшением количества Bacteroides vulgatus и Bacteroides dorei и путей биосинтеза фолиевой кислоты, а также с увеличением содержания гидроксифенилуксусной кислоты, изменений, которые связаны с дисфункцией иммунной системы и воспалительными состояниями. Кроме того, лонгитюдный анализ показал, что у младенцев, не подвергавшихся воздействию какого-либо фактора риска окружающей среды, содержание Bacteroides uniformis и метаболита 3-3-гидроксифенилпропионовой кислоты увеличивается с течением времени, в то время как уровни липоевой кислоты и метановых путей метаболизма снижаются, что связано с благоприятными иммуномодулирующими и противовоспалительными эффектами.
Заключение
В целом, наше исследование даёт беспрецедентное представление об основных таксономических и функциональных сдвигах в развивающейся микробиоте кишечника младенцев с риском CD, связывающих генетические факторы риска и факторы окружающей среды с вредными иммуномодулирующими и воспалительными эффектами.
Ключевые слова: Microbiota, Celiac disease, Multi-omics analysis, gut microbiome
CD – Celiac disease – Целиакия
CDGEMM – Celiac Disease Genomic, Environmental, Microbiome and Metabolome – генома, окружающей среды, микробиома и метаболома целиакии
HLA – Human leukocyte antigen – Человеческий лейкоцитарный антиген
IBD – Inflammatory bowel disease – воспалительное заболевание толстойкики
T1D – Type 1 diabetes – Тип 1 диабета
Абстракт
Предпосылки
Целиакия (CD – Celiac disease) – это аутоиммунное расстройство пищеварения, которое возникает у генетически восприимчивых людей в ответ на употребление глютена, белка, содержащегося в пшенице, ржи и ячмене. Исследования показывают, что генетическая предрасположенность и воздействие глютена необходимы, но не достаточны для того, чтобы спровоцировать развитие CD. Это говорит о том, что воздействие других факторов окружающей среды в раннем возрасте, например, кесарево сечение и воздействие антибиотиков или искусственных смесей, также может играть ключевую роль в патогенезе CD посредством пока неизвестных механизмов. Здесь мы используем мульти-омический анализ, чтобы исследовать, как генетические факторы риска и ранние факторы окружающей среды влияют на развитие кишечной микробиоты у младенцев с риском развития CD.
Результаты
С этой целью мы отобрали 31 младенца из крупномасштабного проспективного когортного исследования новорождённых с родственником первой степени с CD. Затем мы провели тщательный многомерный ассоциативный, поперечный и продольный анализы с использованием метагеномных и метаболомных данных, собранных при рождении, в возрасте 3 месяцев и 6 месяцев, чтобы изучить влияние генетической предрасположенности и факторов риска окружающей среды на состав, функцию и метаболом кишечной микробиоты до введения триггера (глютена).. Эти анализы выявили несколько видов микробов, функциональных путей и метаболитов, которые связаны с каждым генетическим фактором риска и фактором окружающей среды или которые по-разному распространены у младенцев, подвергшихся воздействию окружающей среды, и у детей, не подвергшихся воздействию, или между временными точками. Среди наших важных открытий мы обнаружили, что родоразрешение с помощью кесарева сечения связано с уменьшением количества Bacteroides vulgatus и Bacteroides dorei и путей биосинтеза фолиевой кислоты, а также с увеличением содержания гидроксифенилуксусной кислоты, изменений, которые связаны с дисфункцией иммунной системы и воспалительными состояниями. Кроме того, лонгитюдный анализ показал, что у младенцев, не подвергавшихся воздействию какого-либо фактора риска окружающей среды, содержание Bacteroides uniformis и метаболита 3-3-гидроксифенилпропионовой кислоты увеличивается с течением времени, в то время как уровни липоевой кислоты и метановых путей метаболизма снижаются, что связано с благоприятными иммуномодулирующими и противовоспалительными эффектами.
Заключение
В целом, наше исследование даёт беспрецедентное представление об основных таксономических и функциональных сдвигах в развивающейся микробиоте кишечника младенцев с риском CD, связывающих генетические факторы риска и факторы окружающей среды с вредными иммуномодулирующими и воспалительными эффектами.
Ключевые слова: Microbiota, Celiac disease, Multi-omics analysis, gut microbiome
Предпосылки
Целиакия (СD) – это аутоиммунная энтеропатия, которой страдают три миллиона американцев и 1% населения во всём мире [1]. CD возникает у генетически предрасположенных лиц, которые имеют специфические варианты генов лейкоцитарного антигена человека (HLA) DQ2 и DQ8 в ответ на употребление глютена, белка, содержащегося в пшенице, ржи и ячмене [2]. Примечательно, что CDявляется единственным аутоиммунным заболеванием, для которого известен экологический триггер (употребление глютена) [3]. Учитывая, что время воздействия глютена и дозу глютена, принимаемого внутрь, можно тщательно контролировать, и поскольку удаление глютена приводит к разрешению симптомов и энтеропатии у большинства пациентов [4–8], CD может служить настраиваемой моделью хронических иммунных расстройств [9]. Это позволяет получить представление о его патогенезе не только у лиц с CD, но и у лиц с другими аутоиммунными заболеваниями.
Ожидается, что к 2050 году в глобальном масштабе частота аутоиммунных заболеваний, включая CD, утроится [10, 11], однако гены, связанные с CD (HLA DQ2 и DQ8, а также триггер (глютен), не изменились. Исследования показывают, что более 30% населения являются носителями предрасполагающего гена(ов) и подвержены воздействию триггера, однако только у 2–3% этих людей в течение жизни развивается CD, что свидетельствует о критической роли факторов окружающей среды [12]. Способ родов, тип кормления младенцев, сроки введения глютена в рацион, возникновение вирусных инфекций и раннее воздействие антибиотиков – это лишь некоторые из многих факторов окружающей среды, которые, как предполагается, влияют на развитие хронических воспалительных заболеваний, таких как CD [13]. При независимой оценке этих факторов исследования случай-контроль и мета-анализы показали, что родоразрешение с помощью кесарева сечения [14, 15], отсутствие грудного вскармливания [16, 17], сроки введения глютена [17, 18] и воздействие антибиотиков [19] повышают риск развития CD.
Однако два независимых двойных слепых плацебо-контролируемых проспективных исследования в Европе с участием младенцев с совместимой генетикой HLA и родственников первой степени с CD (которые, следовательно, подвержены высокому риску развития CD) показали, что вагинальные роды, грудное вскармливание и сроки введения глютена не защищают от развития CD [20, 21]. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что кишечная микробиота может быть вовлечена в несколько иммунных расстройств [13], таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) [22], диабет 1 типа (СД1) [23] и рассеянный склероз [24].
Также было начато ограниченное число исследований, направленных на изучение связи между микробиотой кишечника и развитием CD [25–30]. Первоначальные исследования были сосредоточены на вкладе генетики HLA в развивающуюся микробиоту. В частности, в двух исследованиях были проанализированы исключительно грудные вскармливаемые младенцы в возрасте до 4 месяцев с родственником первой степени с CD и обнаружено, что группа Bacteroides-Prevotella [25], Firmicutes, Proteobacteria и Bifidobacterium [26] была более распространена у младенцев с высоким генетическим риском развития CD (те, у кого две копии HLA DQ2). Кроме того, в предварительном проспективном исследовании мы использовали секвенирование ампликона 16S рРНК для изучения микробиоты 16 младенцев с родственником первой степени с CD и с совместимым типом HLA и обнаружили более низкое содержание бактерий и более высокое содержание Firmicutes у этих субъектов по сравнению с контрольной группой [27].
В других исследованиях микробиоты кишечника и CD оценивались изменения в течение 1 года в составе микробиоты лиц, у которых позже развился CD, по сравнению с контрольной группой [29, 30].Например, Olivares et al. [29] выявили увеличение численности Firmicutes, Enterococcaceae и Peptostreptococcaceae при контроле от 4 до 6 месяцев, но в случаях не наблюдалось различий во времени [29]. В то время как связь между факторами окружающей среды и изменениями в микробиоте кишечника лиц, находящихся в группе риска, недавно была изучена при ряде хронических иммунных расстройств [31, 32], исследований, посвящённых этому вопросу при CD, мало [28]. Единственным исследованием в этом направлении является работа Pozo-Rubio et al. [28], где они обнаружили ассоциации между ограниченным числом предварительно отобранных таксонов фекальных микробов у субъектов, подверженных риску CD, и способом доставки, типом кормления младенцев, воздействием антибиотиков и введением ротавирусной вакцины [28].
Хотя эти исследования дали ценную информацию о развитии микробиоты кишечника в раннем возрасте у лиц, подверженных риску CD, твёрдая пища уже была введена в рацион младенцев во многих из этих исследований без учёта её влияния на микробиоту. Кроме того, насколько нам известно, в настоящее время не существует общемикробного исследования влияния факторов риска окружающей среды на CD. Что ещё более важно, существующие исследования в основном основаны на секвенировании ампликона 16S рРНК, которое не способно полностью объяснить, как функциональная характеристика микробиоты повлияет на возникновение CD. Чтобы смягчить эти ограничения, здесь мы используем крупномасштабное проспективное когортное исследование генома, окружающей среды, микробиома и метаболома целиакии (CDGEMM – Celiac Disease Genomic, Environmental, Microbiomeand Metabolome) [33], в ходе которого мы наблюдали за более чем 400 младенцами с CD у родственников первой степени, которые, таким образом, подвергаются высокому риску развития CD. В этом исследовании мы представляем многомерную ассоциацию, а также межпредметный и внутрипредметный анализы с использованием метагеномных и метаболомных данных, собранных в течение первых 6 месяцев после рождения, для изучения влияния как генетических, так и экологических факторов риска на развитие кишечной микробиоты младенцев с риском CD до введения твёрдой пищи.
Результаты
Для этого исследования мы отобрали 31 ребёнка, набранного в когорту CDGEMM, у которых образцы кала были доступны при рождении, через 3 месяца и через 4–6 месяцев (см. рис. Рис.1,1, таблица Table1,1 и дополнительный файл 1 для более подробных мета-данных). Ни один из этих младенцев не употреблял твёрдую пищу до 6 месяцев, что делает их идеальными для изучения влияния генетических факторов риска и факторов окружающей среды на микробиоту кишечника в отсутствие глютена в качестве мешающего фактора. Двадцать шесть из этих младенцев были генетически восприимчивы к развитию CD, из которых 19 были либо гетерозиготными по DQ2 или DQ8, либо несли как DQ2, так и DQ8 (далее именуемые «стандартный генетический риск»), а семь были гомозиготными по DQ2 (далее именуемые «высокий генетический риск»). Кроме того, 19 младенцев, которые были генетически предрасположены к CD и которые подвергались воздействию, по крайней мере, одного фактора риска окружающей среды, упоминаются как «подверженные воздействию окружающей среды» младенцы на протяжении всей остальной части рукописи. Факторы окружающей среды, которые мы рассмотрели в этом исследовании, включают модель родов, воздействие антибиотиков и тип кормления младенцев.
Таким образом, дети, подвергшиеся воздействию окружающей среды, - это те, кто родился с помощью кесарева сечения или подвергался воздействию антибиотиков при рождении или во время родов (т.е. антибиотики вводились матери во время родов), или не получали исключительно грудного молока (т.е. получали искусственные смеси или как искусственные смеси, так и грудное молоко). Выбор этих факторов риска окружающей среды и их группировка имеет клиническое значение, поскольку родоразрешение с помощью кесарева сечения часто связано с приёмом антибиотиков при рождении и искусственным вскармливанием из-за задержки выработки грудного молока. Семь младенцев, которые были генетически восприимчивы и которые не подвергались воздействию ни одного из этих факторов риска окружающей среды, т.е. те, кто родился вагинально и не подвергался воздействию антибиотиков во время родов и питался исключительно грудным молоком, далее упоминаются как «не подверженные воздействию окружающей среды» (см. рис. Рис.11).
Целиакия (СD) – это аутоиммунная энтеропатия, которой страдают три миллиона американцев и 1% населения во всём мире [1]. CD возникает у генетически предрасположенных лиц, которые имеют специфические варианты генов лейкоцитарного антигена человека (HLA) DQ2 и DQ8 в ответ на употребление глютена, белка, содержащегося в пшенице, ржи и ячмене [2]. Примечательно, что CDявляется единственным аутоиммунным заболеванием, для которого известен экологический триггер (употребление глютена) [3]. Учитывая, что время воздействия глютена и дозу глютена, принимаемого внутрь, можно тщательно контролировать, и поскольку удаление глютена приводит к разрешению симптомов и энтеропатии у большинства пациентов [4–8], CD может служить настраиваемой моделью хронических иммунных расстройств [9]. Это позволяет получить представление о его патогенезе не только у лиц с CD, но и у лиц с другими аутоиммунными заболеваниями.
Ожидается, что к 2050 году в глобальном масштабе частота аутоиммунных заболеваний, включая CD, утроится [10, 11], однако гены, связанные с CD (HLA DQ2 и DQ8, а также триггер (глютен), не изменились. Исследования показывают, что более 30% населения являются носителями предрасполагающего гена(ов) и подвержены воздействию триггера, однако только у 2–3% этих людей в течение жизни развивается CD, что свидетельствует о критической роли факторов окружающей среды [12]. Способ родов, тип кормления младенцев, сроки введения глютена в рацион, возникновение вирусных инфекций и раннее воздействие антибиотиков – это лишь некоторые из многих факторов окружающей среды, которые, как предполагается, влияют на развитие хронических воспалительных заболеваний, таких как CD [13]. При независимой оценке этих факторов исследования случай-контроль и мета-анализы показали, что родоразрешение с помощью кесарева сечения [14, 15], отсутствие грудного вскармливания [16, 17], сроки введения глютена [17, 18] и воздействие антибиотиков [19] повышают риск развития CD.
Однако два независимых двойных слепых плацебо-контролируемых проспективных исследования в Европе с участием младенцев с совместимой генетикой HLA и родственников первой степени с CD (которые, следовательно, подвержены высокому риску развития CD) показали, что вагинальные роды, грудное вскармливание и сроки введения глютена не защищают от развития CD [20, 21]. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что кишечная микробиота может быть вовлечена в несколько иммунных расстройств [13], таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) [22], диабет 1 типа (СД1) [23] и рассеянный склероз [24].
Также было начато ограниченное число исследований, направленных на изучение связи между микробиотой кишечника и развитием CD [25–30]. Первоначальные исследования были сосредоточены на вкладе генетики HLA в развивающуюся микробиоту. В частности, в двух исследованиях были проанализированы исключительно грудные вскармливаемые младенцы в возрасте до 4 месяцев с родственником первой степени с CD и обнаружено, что группа Bacteroides-Prevotella [25], Firmicutes, Proteobacteria и Bifidobacterium [26] была более распространена у младенцев с высоким генетическим риском развития CD (те, у кого две копии HLA DQ2). Кроме того, в предварительном проспективном исследовании мы использовали секвенирование ампликона 16S рРНК для изучения микробиоты 16 младенцев с родственником первой степени с CD и с совместимым типом HLA и обнаружили более низкое содержание бактерий и более высокое содержание Firmicutes у этих субъектов по сравнению с контрольной группой [27].
В других исследованиях микробиоты кишечника и CD оценивались изменения в течение 1 года в составе микробиоты лиц, у которых позже развился CD, по сравнению с контрольной группой [29, 30].Например, Olivares et al. [29] выявили увеличение численности Firmicutes, Enterococcaceae и Peptostreptococcaceae при контроле от 4 до 6 месяцев, но в случаях не наблюдалось различий во времени [29]. В то время как связь между факторами окружающей среды и изменениями в микробиоте кишечника лиц, находящихся в группе риска, недавно была изучена при ряде хронических иммунных расстройств [31, 32], исследований, посвящённых этому вопросу при CD, мало [28]. Единственным исследованием в этом направлении является работа Pozo-Rubio et al. [28], где они обнаружили ассоциации между ограниченным числом предварительно отобранных таксонов фекальных микробов у субъектов, подверженных риску CD, и способом доставки, типом кормления младенцев, воздействием антибиотиков и введением ротавирусной вакцины [28].
Хотя эти исследования дали ценную информацию о развитии микробиоты кишечника в раннем возрасте у лиц, подверженных риску CD, твёрдая пища уже была введена в рацион младенцев во многих из этих исследований без учёта её влияния на микробиоту. Кроме того, насколько нам известно, в настоящее время не существует общемикробного исследования влияния факторов риска окружающей среды на CD. Что ещё более важно, существующие исследования в основном основаны на секвенировании ампликона 16S рРНК, которое не способно полностью объяснить, как функциональная характеристика микробиоты повлияет на возникновение CD. Чтобы смягчить эти ограничения, здесь мы используем крупномасштабное проспективное когортное исследование генома, окружающей среды, микробиома и метаболома целиакии (CDGEMM – Celiac Disease Genomic, Environmental, Microbiomeand Metabolome) [33], в ходе которого мы наблюдали за более чем 400 младенцами с CD у родственников первой степени, которые, таким образом, подвергаются высокому риску развития CD. В этом исследовании мы представляем многомерную ассоциацию, а также межпредметный и внутрипредметный анализы с использованием метагеномных и метаболомных данных, собранных в течение первых 6 месяцев после рождения, для изучения влияния как генетических, так и экологических факторов риска на развитие кишечной микробиоты младенцев с риском CD до введения твёрдой пищи.
Результаты
Для этого исследования мы отобрали 31 ребёнка, набранного в когорту CDGEMM, у которых образцы кала были доступны при рождении, через 3 месяца и через 4–6 месяцев (см. рис. Рис.1,1, таблица Table1,1 и дополнительный файл 1 для более подробных мета-данных). Ни один из этих младенцев не употреблял твёрдую пищу до 6 месяцев, что делает их идеальными для изучения влияния генетических факторов риска и факторов окружающей среды на микробиоту кишечника в отсутствие глютена в качестве мешающего фактора. Двадцать шесть из этих младенцев были генетически восприимчивы к развитию CD, из которых 19 были либо гетерозиготными по DQ2 или DQ8, либо несли как DQ2, так и DQ8 (далее именуемые «стандартный генетический риск»), а семь были гомозиготными по DQ2 (далее именуемые «высокий генетический риск»). Кроме того, 19 младенцев, которые были генетически предрасположены к CD и которые подвергались воздействию, по крайней мере, одного фактора риска окружающей среды, упоминаются как «подверженные воздействию окружающей среды» младенцы на протяжении всей остальной части рукописи. Факторы окружающей среды, которые мы рассмотрели в этом исследовании, включают модель родов, воздействие антибиотиков и тип кормления младенцев.
Таким образом, дети, подвергшиеся воздействию окружающей среды, - это те, кто родился с помощью кесарева сечения или подвергался воздействию антибиотиков при рождении или во время родов (т.е. антибиотики вводились матери во время родов), или не получали исключительно грудного молока (т.е. получали искусственные смеси или как искусственные смеси, так и грудное молоко). Выбор этих факторов риска окружающей среды и их группировка имеет клиническое значение, поскольку родоразрешение с помощью кесарева сечения часто связано с приёмом антибиотиков при рождении и искусственным вскармливанием из-за задержки выработки грудного молока. Семь младенцев, которые были генетически восприимчивы и которые не подвергались воздействию ни одного из этих факторов риска окружающей среды, т.е. те, кто родился вагинально и не подвергался воздействию антибиотиков во время родов и питался исключительно грудным молоком, далее упоминаются как «не подверженные воздействию окружающей среды» (см. рис. Рис.11).
